流式细胞仪用激光器
流式细胞术作为现代生物医学研究和临床诊断的重要工具，集成了光学、电子学、流体力学、计算机科学等多学科技术，能够对细胞或生物颗粒进行高速、多参数的定量分析和分选。自20世纪70年代发展以来，流式细胞技术已在免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学等领域发挥了不可替代的作用。
1.流式细胞术的基本原理
流式细胞术的基础原理可追溯至20世纪60年代，经过半个多世纪的发展，如今已能在每秒数万个细胞的速度下，同时检测细胞的大小、颗粒度、荧光强度等数十种参数，为生命科学研究提供了强有力的工具支持。
流式细胞仪（Flow Cytometer）核心功能是对悬浮在流体中的单细胞或生物颗粒进行快速、多参数的定量分析与分选。其工作机制建立在三大关键技术基础上：流体动力学聚焦、光学检测和电子信号处理。在流体动力学聚焦过程中，细胞样本首先被制备成单细胞悬液，然后在流式细胞仪的流动室中，细胞被鞘液包围，通过精确控制鞘液和样本流的流速与压力，使细胞在鞘液裹挟下呈单列依次通过检测区域，这种"单细胞流"技术保证了每个细胞能被单独检测，避免了细胞重叠通过激光束而造成的信号混淆。流体动力学聚焦技术是流式细胞仪实现高通量单细胞分析的关键，它使得仪器能够以每秒数千至数万个细胞的速度进行分析。
流式细胞仪的工作原理
当细胞单列通过检测区域时，会受到一束或多束激光的照射，产生不同类型的光信号。这些信号主要包括散射光和荧光。散射光又分为前向散射光（Forward Scatter， FSC）和侧向散射光（Side Scatter， SSC），前者与细胞的大小和表面积相关，后者则反映细胞的内部结构和颗粒复杂度。通过同时检测FSC和SSC，可以区分不同种类的细胞群，例如在血液样本中区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。
荧光信号则来源于细胞自身或与细胞结合的荧光标记物。当激光束激发荧光染料时，这些染料会吸收特定波长的光能并发射出更长波长的光。流式细胞仪可同时检测多种荧光信号，通过对细胞进行多重标记，可以获取关于细胞表面标志物、细胞内分子、细胞功能状态等多维信息。荧光检测的灵敏度极高，能够探测到细胞上低至几千个荧光分子的信号。
光信号被收集后，会通过一系列光学滤光片和镜片引导至相应的光电检测器，将光信号转换为电信号。这些微弱的电信号经过放大器放大后，由模数转换器转换为数字信号，最终传输至计算机进行存储和分析。现代流式细胞仪配备的专用软件不仅能实时显示数据，还能进行复杂的后期分析，如群体设门（Gating）、细胞周期分析和增殖分析等。
流式细胞仪检测的主要信号类型及生物学意义总结如下：
信号类型 | 简称 | 产生原因 | 反映的生物学特性 |
前向散射光 | FSC | 激光在细胞表面衍射 | 细胞大小和表面积 |
侧向散射光 | SSC | 激光在细胞内折射和反射 | 细胞内部结构和颗粒度 |
荧光信号 | FL1, FL2等 | 荧光标记物被激发 | 特定分子表达水平或细胞功能状态 |
时间参数 |
| 细胞通过检测点时间 | 细胞流速稳定性 |
值得一提的是，随着技术进步，流式细胞技术已从传统的荧光流式发展为包含多种检测原理的多元化技术平台。拉曼散射流式、质谱流式（CyTOF）和图像流式等新型流式技术不断拓展着研究人员的视野。特别是基于光学时域拉伸成像（OTS）技术的光流控成像流式细胞仪，具有超短曝光时间、高空间分辨率、实时高通量分析及连续实时成像等优势，理论通量可达百万级，代表了流式细胞技术的前沿发展方向。
2.流式细胞仪的系统组成
流式细胞仪作为一项高度集成的精密分析仪器，其系统架构融合了多种工程技术，主要包括液流系统、光学系统、检测系统和数据分析系统（检测分析系统）四大核心部分。这些子系统协同工作，共同完成了从样本输入到数据输出的复杂分析流程。
液流系统是流式细胞仪的基础支撑部分，负责将细胞悬液中的待测细胞单列传输至激光检测区。该系统由样本进样装置、鞘液容器、流动室和废液收集装置等部件构成。
光学系统是流式细胞仪的"眼睛"，承担着激发样本和收集光信号的双重任务，其核心部件包括激光器、光学透镜组和检测器。激光器作为激发光源，其波长和功率直接影响检测灵敏度和荧光标记。现代高端流式细胞仪一般采用四波长的激光波长组合，典型波长405nm、488nm、561nm和640nm。激光光束通过一系列透镜聚焦于流动室中的检测点，形成椭圆形或扁平线状的光斑。当细胞通过激光束时产生的散射光和荧光信号，通过收集透镜汇聚后，被引导至相应的检测器。分光器件（如二向色镜和带通滤光片）负责将不同波长的光信号分配到特定检测通道。检测器方面，传统光电倍增管（PMT）逐渐被硅光电倍增管（SiPM）等新型器件部分取代，后者具有更高的灵敏度和更低的噪声。
流式细胞仪的系统组成
检测系统扮演着信号转换与放大的角色，主要包括放大器、模数转换器（ADC）和实时处理单元。电子系统协调仪器各部分的时序，控制激光触发、液流稳定性和检测同步性，是流式细胞仪的"神经系统"。
数据分析系统构成了流式细胞仪的"大脑"，负责数据的存储、显示和分析。随着流式细胞分析参数的增加（现代仪器可同时检测超过50个参数）和实验复杂度的提升，数据处理系统面临着巨大挑战。近年来，全光谱流式细胞仪的出现对数据分析提出了更高要求，这类仪器捕捉每一种荧光染料的完整发射光谱，通过算法解析获得每个荧光染料的相对贡献。
流式细胞仪各组成部分的功能和性能指标，汇总如下：
系统名称 | 核心部件 | 主要功能 | 性能指标 |
液流系统 | 样本泵、鞘液室、流动室 | 单细胞流形成与传输 | 流速稳定性（CV值） |
光学系统 | 激光器、透镜、滤光片、检测器 | 激发样本与信号收集 | 激光稳定性、检测灵敏度 |
电子系统 | 放大器、模数转换器 | 信号转换与放大 | 分辨率、采样率 |
数据处理系统 | 计算机、专用软件 | 数据存储、显示与分析 | 分析参数数量、处理速度 |
流式细胞仪的技术进步与其系统组成部件的创新密不可分。以光流控时域拉伸成像流式细胞仪（OTS-IFC）为例，这种新型流式细胞仪将光学时域拉伸技术与微流控系统相结合，实现了超短曝光时间（皮秒级）下的高速成像流式检测，理论通量达百万级细胞每秒，为传统流式细胞仪难以实现的应用如稀有细胞鉴定、细胞形态动力学研究等提供了全新解决方案。
3.用于流式的典型激光器
流式细胞仪使用的激光器，要求极高。在实际应用中，激光参数的设置需要根据样本类型、标记策略和检测目标（如表面标志物与细胞内因子）进行优化调整。随着技术的发展，流式细胞仪的激光系统正朝着更高功率稳定性、更宽波长覆盖和更紧凑模块化的方向演进。
现代高端流式细胞仪普遍采用多通道的激光器配置以满足复杂实验需求,包含四波长激光及以上系统：如349/375nm/405nm/488nm/561nm/638nm/808nm组合，支持21色以上分析，光谱覆盖全面，串扰极小。
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单波长流式光源 | 多波长组合流式光源 |
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261、320、349、355、375、405、488, 532、561、638、640、808nm...等等，可定制。 | 349/405/488/640/561组合、405/488/640/561组合..等等，可定制。 |
4.流式细胞术的应用
流式细胞技术以其高通量、多参数、高灵敏度的独特优势，已经渗透到生命科学研究和临床应用的众多领域。从基础的细胞生物学研究到前沿的精准医疗实践，流式细胞仪发挥着不可替代的作用。随着技术的不断进步和创新，流式细胞术的应用范围持续扩展，为科学发现和疾病诊疗提供了强有力的工具支持。
流式细胞术对人全血进行免疫分型
流式细胞术在临床诊断中的典型应用总结如下：
疾病领域 | 检测项目 | 临床意义 | 常用标志物组合 |
血液肿瘤 | 白血病免疫分型 | 诊断分型（WHO标准） | CD45/CD34/CD19/CD13等 |
免疫缺陷 | CD4+ T细胞计数 | HIV疾病监测 | CD3/CD4/CD8 |
移植医学 | 嵌合体分析 | 移植后监测 | 供受体特异性HLA抗体 |
实体肿瘤 | CTC检测 | 预后评估 | EpCAM/CK/CD45 |
自身免疫病 | 淋巴细胞亚群 | 疾病活动度评估 | CD4/CD25/FoxP3 |
随着技术进步，流式细胞仪的应用边界不断拓展。例如，质谱流式（CyTOF）可同时检测超过40个参数，大幅提升系统免疫学研究能力；而图像流式（Imaging Flow Cytometry）则整合了形态学信息，为细胞功能研究提供新维度。在精准医疗时代，流式细胞技术将继续在疾病分子分型、治疗反应预测和个体化治疗策略制定中发挥核心作用。
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